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本试剂盒是一次性可同时处理96个不同样品的质粒小量抽提试剂盒。本试剂盒将磁性纳米分离技术和细菌细胞的SDS碱裂解法结合从菌体中提取高质量的质粒DNA。在离心力的作用下细胞碎片和SDS复合物沉淀下来。在一定的条件下磁珠能很好的吸附上清中的质粒DNA，其他杂质如蛋白质、盐离子等通过洗涤被除去。当条件改变时，磁珠释放吸附的质粒DNA。对于高拷贝质粒，从2mL过夜培养的菌液（OD₆₀₀=2.0）中可以获得超过15μg的质粒DNA。

本试剂盒抽提得到的质粒纯度高，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值一般为1.8～1.9之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值大于2.0，可直接用于转化、DNA测序、PCR和酶切等后续实验。

• 操作快速简单，60min之内可完成96个不同样品的提取。
  
• 无需离心，实现质粒提取的高通量化和自动化。
  
• 抽提得到的质粒浓度高、纯度好，可直接用于后续实验。

• 加入RNase A的Buffer P1请存放于2～8℃。
  
• Buffer P3中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

• 在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株，于37℃摇床充分振荡培养12-16h。
  
  • 菌液状态对质粒DNA得率非常关键，请用不超过容器容量1/4体积的培养基进行培养。
    
  • 处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高，过度培养可能导致DNA降解。
• 对于高拷贝质粒，取2mL菌液分别加入Deep Well Collection Plate中，室温4000rpm离心2min收集菌体，吸净上清。
  
  • 对于高拷贝质粒，从2mL过夜培养菌液中通常可以获得超过15μg质粒DNA，不推荐使用更大的菌液量。
    
  • 对于低拷贝质粒，如果使用更多的菌液，则同一个样品分多管收集，每管不超过5mL，分别裂解，然后用同一批SgMag Beads吸附质粒DNA获得更高的得率。
• 向菌体沉淀中加入250μL Buffer P1，吸打至彻底悬浮菌体。
  
  • Buffer P1首次使用时请检查是否已加入RNase A。
    
  • 请彻底悬浮菌体，否则影响得率和质量。
• 加入250μL Buffer P2，用新的Sealing Film封口后立即温和颠倒Deep Well Collection Plate 5～10次，室温静置2～4min至完全裂解。
  
  • 裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，最长不能超过5min。
    
  • 混匀时，动作要温和，如果剧烈震荡，可能把基因组DNA打断混杂在质粒中。
    
  • 混匀后应短暂低速离心后再将Sealing Film取下，避免样品间交叉污染。
• 加入350μL Buffer P3，用Sealing Film封口后立即温和颠倒Deep Well Collection Plate 5～10次，充分混匀。
  
  • 如果起始菌液较多，混匀后室温静置2min以彻底去除RNA。
• 于离心机最大转速离心20min，将上清全部小心移入新的Deep Well Collection Plate，然后向上清液中加入25μL SgMag Beads，温和吸打混匀，室温结合3min，间或混匀。
  
  • 加SgMag Beads之前，请将其充分混匀。
    
  • 请务必将SgMag Beads加至液面以下。
• 将Deep Well Collection Plate置于磁分离板上1～2min，待SgMag Beads完全吸至孔壁上，吸弃上清，然后从磁分离板上取出Deep Well Collection Plate。
  
  • 吸弃上清前，若孔口粘有少量SgMag Beads，请用上清液将其洗至孔内，以确保所有SgMag Beads吸附至孔壁上。
    
  • 吸弃上清时，请勿吸入SgMag Beads，尽量吸净上清。
    
  • 从磁分离板上取出Deep Well Collection Plate后，若有少量上清，请将其置于磁分离上，再次吸取上清。
• 向Deep Well Collection Plate中加入900μL 70%乙醇，吸打混匀，将Deep Well Collection Plate置于磁分离板上1min，待SgMag Beads完全吸至孔壁上之后，吸弃上清，从磁分离板上取出Deep Well Collection Plate。
  
  • 吸弃上清前，若孔口粘有少量SgMag Beads，请用上清液将其洗至孔内，以确保所有SgMag Beads吸附至孔壁上。
    
  • 吸上清时，请勿吸入SgMag Beads，尽量吸净上清。
• 重复步骤8一次，室温干燥15～20min或者55℃恒温箱中干燥5～7min至孔内无液体残留。
  
  • 干燥前，请尽量将管内液体吸干。
    
  • 干燥前，若出现液体挂壁现象，可将Deep Well Collection Plate短暂离心之后，再将其置于磁分离板上，待所有SgMag Beads完全吸至孔壁之后再吸净孔内液体。
• 加入50～100μL的TE Buffer（pH8.0），使SgMag Beads充分悬浮在TE buffer中，室温洗脱3～5min，间或混匀。
  
  • 请将孔壁上所有SgMag Beads充分悬浮在TE Buffer中
    
  • 根据实验需要可以将TE Buffer（pH8.0）用无菌的双蒸水（pH>7.5）代替。
• 将Deep Well Collection Plate置于磁分离板上1min，待SgMag Beads完全吸至孔壁上，吸取上清至96 Well Storage Plate，即获得纯的质粒DNA。
  
  • 吸取上清前，请确保所有SgMag Beads完全吸至孔壁，请勿吸入SgMag Beads，否则影响产物纯度。

• 未提取出质粒或质粒得率较低
  
  • 菌株老化。请涂布平板培养后，重新挑选单菌落进行液体培养。
    
  • 质粒拷贝数低。由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可以使用更多的菌量但需要相应增加溶液使用量。
    
  • 菌体中无质粒。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
    
  • 碱裂解不充分。使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加Buffer P1，P2和P3的用量。
    
  • 溶液使用不当。Buffer P2和P3在温度较低时可能出现沉淀，应置于37℃温浴直至沉淀溶解，待冷却至室温后使用。
    
  • 洗脱液不合适。洗脱效率与洗脱液的pH值有关，如果使用水进行洗脱，请确保其pH> 7.5，如果pH过低可能导致洗脱量低，可以用1mol/L氢氧化钠溶液调节水的pH值。
    
  • 溶液失效。Buffer P2长期暴露在空气中容易失效，请每次使用完后，立即盖紧瓶塞，以免失效，造成碱裂解不充分。
    
  • 结合不充分。加入SgMag Beads之后，请将其充分混匀，并使SgMag Beads处于悬浮状态；结合时间为3～5min，间或混匀。
    
  • 操作过程中丢失SgMag Beads。结合及洗涤过程中可能有少量的SgMag Beads粘在孔口上，吸弃上清前请用少量的上清液清洗孔口，使粘在孔口的SgMag Beads也吸附在孔壁上。
    
  • 洗脱过程操作不当。洗脱时请将孔壁上所有SgMag Beads充分悬浮在TE Buffer中。
    
  • 洗脱时间较短。请将SgMag Beads充分悬浮在TE buffer中，洗脱3～5min，间或混匀。
• 质粒纯度不高
  
  • 混有蛋白。请勿使用过多菌体。经Buffer P1，P2和P3处理，离心后溶液应为澄清，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心，并延长离心时间，完全沉淀蛋白后再取上清。
    
  • 混有RNA。RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入Buffer P3后室温再延长放置时间5～10min。如果Buffer P1已保存6个月以上，请在Buffer P1中再添加终浓度为100μg/mL的RNase A。
    
  • 混有基因组DNA。加入Buffer P2后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA打断从而混杂在质粒中。如果加入Buffer P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞内DNA的降解，培养时间不要超过16h。
    
  • 质粒的二聚体和多聚体形式。质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。
    
  • 乙醇有残留。请吸弃上清之后从磁分离板上取出Deep well Collection Plate，放置2min之后再将Deep well Collection Plate置于磁分离板上30 s，吸净管底的液体。若出现残液的挂壁现象，请短暂离心之后再将Deep well Collection Plate置于磁分离板上30 s，吸净孔内的液体。
    
  • SgMag Beads洗涤不充分。向Deep well Collection Plate中加入70%乙醇以后，请充分混匀，使SgMag Beads充分悬浮在70%乙醇中。
    
  • SgMag Beads没有完全干燥。请将SgMag Beads完全干燥，保证无乙醇残留。
    
  • 最后一步吸取上清时吸入SgMag Beads。请确保所有SgMag Beads吸至孔壁上，再吸取上清。如果不小心吸入SgMag Beads，请将上清液放回原孔，待SgMag Beads完全吸至孔壁之后重新吸取上清。或者将吸取的上清DNA溶液10000rpm离心2min，再取上清。